來源：醫藥魔方 作者：陽光德美
2020年新冠病毒爆發，人們在經歷了這樣一場醫療戰役之后，對現今醫療手段有了更多的認識。在漫長的人類進化過程和與疾病的對抗過程中，醫療手段不斷的升級換代，從藥物治療、手術治療發展到了一個新的階段、新的領域——細胞療法。細胞療法作為第三代醫療手段，不論是利用自身細胞抗癌的“過繼性免疫細胞治療”，還是萬能的“干細胞療法”，都展現出巨大的前景。
本文對細胞療法的發展做一綜述，并對細胞治療產品的特點和臨床試驗相關檢測進行簡要介紹。
細胞療法的發展歷程
過繼性免疫細胞療法是從患者體內取出具有抗癌能力的T細胞，在體外進行增殖，然后再注射回患者體內，從而達到清除腫瘤細胞的作用。這種療法不同于常規的放療、化療，回注體內的T細胞只針對腫瘤細胞高度特異性清除，對于身體的傷害較小，因此成為目前很有潛力和挑戰的療法。
科學家嘗試使用了很多種T細胞來研究，免疫細胞療法目前也經歷了4次技術革新
從1976年Morgan等人發現白介素2 (IL-2)對T 細胞的擴增效應并大量生產后，科學家利用IL-2誘導出LAK（Lymphokine Activated Killer）細胞，用于治療黑色素瘤、肺癌等多種惡性腫瘤。這是最早的過繼性免疫細胞治療方法。但是LAK細胞因為需要依賴大劑量的IL-2，治療副作用較大，最常見和最嚴重的毒副作用是出現毛細血管滲漏綜合征(CLS)，主要表現為全身性水腫和多器官功能失調，可引起胸腹腔積液、肺間質水腫和充血性心力衰竭。
在LAK 療法后，Rosenberg 等人從腫瘤附近組織中分離出TIL（tumor-infiltrating lymphocytes）細胞。與LAK療法相比，TIL 療法具有一定的腫瘤特異性，臨床效果優于LAK 療法，小鼠實驗證實其殺瘤效果比LAK高50-100倍。TIL技術體系比較復雜，培養成功率不高，極大地限制了臨床應用，但是隨著近些年培養技術的發展，相信也會取得很好的臨床進展。
1991年斯坦福大學醫學院骨髓移植中心報道了具有高增殖力和高細胞毒性的CIK（Cytokine Induced Killer）細胞。CIK技術的出現, 首次擺脫了細胞培養及回輸過程中對大劑量IL-2的依賴, 明顯減少了患者的臨床副反應。在國內，CIK技術大力發展, 已有超過五百家醫院將CIK及CIK基礎上的細胞治療技術用于腫瘤患者的治療, 并證實CIK技術能明顯改善患者生活質量, 延長晚期腫瘤患者的生存期。
2010年4月獲批的DC（Dendritic Cell）疫苗Sipuleucel-T，是FDA批準的首個治療性癌癥疫苗，就是通過粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和前列腺酸性磷酸酶（PAP）刺激獲得了激活的免疫細胞，DC通過激發機體的免疫功能而抗腫瘤, 屬于主動免疫治療技術。
此后，出現了DC 和CIK 治療聯用，構建出腫瘤特異的殺傷性T 細胞。自此開始，細胞治療進入了一個“個體化，精準化”的階段。
隨著基因技術的發展，科學家嘗試以病毒為載體對T細胞進行改造。從患者體內提取T細胞進行體外擴增的同時，向T細胞插入新的基因，增強它們識別攻擊腫瘤細胞的能力。
TCR-T （T-cell receptor engineered T cells)是利用患者自身的外周血T 細胞，通過基因修飾將針對腫瘤相關抗原的TCR 序列轉入T 細胞中，成為腫瘤抗原特異性T細胞，是針對不同患者腫瘤抗原的差異所進行的“個體化”治療。但是由于TCR-T是主要組織相容性復合體（MHC）限制性的，僅能用于患者自身的治療，這限制了TCR-T 臨床應用的延展性。
此后應運而生的CAR療法的原理與TCR療法相似，通過基因轉導使患者的T細胞能夠表達嵌合抗原受體CAR，將改造后的T細胞回輸至患者體內，生成大量特異性識別腫瘤的CAR-T細胞從而殺死腫瘤細胞。CAR-T細胞是以非MHC限制性的方式識別腫瘤細胞的，因此得到了更廣泛的應用。到目前為止，CAR 載體構建已發展到第4 代，具有更好的特異性。
抗CD19 CAR-T在血液系統惡性腫瘤的研究上取得了令人矚目的成績，已于2017年正式在歐美國家上市。4月21日，藥審中心（CDE）官網顯示，國內的首個靶向 CD30 的自體 CAR-T 細胞療法獲批臨床。
如今，除CAR-T外，很多免疫細胞如NK細胞、γδT細胞和DC等也是治療腫瘤的理想選擇，并且也與基因改造技術結合起來成為腫瘤免疫細胞治療研究的新方向。
干細胞療法的研究始于20世紀60年代，加拿大科學家Ernest A. McCulloch 與 James E. Till在1963年首次證明了血液中干細胞的存在，造血干細胞可以分化成多種細胞。
1967年，美國華盛頓大學的E. Donnall Thomas完成第一例骨髓移植治療造血功能障礙，此項研究于1990年獲得諾貝爾醫學和生理學獎。1998年，人類胚胎干細胞在體外生長和增殖成功。1999年，Goodell等人發現小鼠肌肉組織的成體干細胞可以“橫向分化”為血液細胞，這打破了用于臨床治療的干細胞只能來源于胚胎或受精卵的限制，為干細胞治療疾病提供了新途徑。1999 年以來，干細胞與再生醫學領域研究成果先后11 次入選Science 雜志年度十大科技突破，彰顯出科學界對該領域的高度重視。另外，在利用干細胞構建組織、器官方面，科研人員已經在體外利用干細胞培養獲得“微型器官”，構建了肝臟、腦和腎臟。
干細胞療法主要基于成體干細胞的3大理論：1）干細胞具有無限繁殖能力和向所有細胞轉化的能力；2）干細胞通過其產生的外泌體和生長因子實現對近乎所有組織器官細胞的轉化再生替代和修復重建功能，從而改善器官功能；3）經過對干細胞的基因“修飾”能提升其對靶向細胞的修復能力和有效性控制能力。2007年日本科學家對誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的成功研究結果完全顛覆了對生命以及干細胞的傳統認知，繞開了胚胎干細胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，成為了干細胞研究的新熱點，并形成了干細胞療法第4理論：用特殊手段誘導成體細胞逆轉成為具有胚胎干細胞分化功能的細胞，即iPSC理論。
臨床上研究較多的干細胞治療的疾病有白血病、惡性貧血、再生障礙性貧血、肝硬化、克羅恩病、小兒自閉癥、腦癱、帕金森癥、阿爾茲海默癥、糖尿病、糖尿病足、系統性紅斑狼瘡、關節炎、風濕性關節炎、類風濕性關節炎、移植物抗宿主病、急性心肌梗死、腫瘤等，涉及面可謂多樣化。這種疾病治療的多樣性，是由干細胞治療機制的復雜性決定的。
目前全球有 13種干細胞產品獲批上市，涉及的適應癥包括膝骨關節炎、心血管、移植物抗宿主病、克羅恩病等，我國在干細胞領域的研究也位于世界前列，尤其是在間充質干細胞的研究上，雖然很多都還處在臨床I、II 期，但未來可期。
就現在公開的文獻資料來看干細胞臨床研究主要集中在造血干細胞（HSC）和間充質干細胞(MSC)上，近些年神經干細胞(NSC)和多能干細胞(PSC)也被認為有很好的發展前景。
有研究嘗試通過流產胎腦和自身骨髓或臍帶血間充質干細胞誘導分化獲得神經干細胞，來治療神經膠質瘤、肌萎縮性側索硬化（ALS）、慢性脊髓損傷和中風等神經損傷疾病，相關研究最快的也還處在臨床II期。
誘導性多能干細胞iPSC由于基因編輯而產生的致瘤風險臨床應用較少。目前報道的iPSC對角膜修復、心臟病治療和帕金森治療的研究上取得了一定的進展，但還需要大量的臨床研究才能看到存在的問題。
造血干細胞研究的適應癥主要是血液系統的惡性腫瘤，這類研究報告的不良反應較多，多數與合并使用的放化療和移植前的預處理有關；另外由于移植時采用異體細胞，易出現急慢性移植物抗宿主?。℅VHD），并影響患者預后。但近年來也有人用自體造血干細胞嘗試治療一些肝臟和缺血性疾病等，不良反應報告相對較少。
間充質干細胞是除造血干細胞外開展臨床研究最多的干細胞類型, 我國在間充質干細胞上的研究已經非常領先了。間充質干細胞在動物試驗中，具有良好的安全性和低免疫原性，未見明顯的毒性反應和致瘤性，因此應用廣泛。在新冠肺炎爆發期間，干細胞治療也被用于重癥新冠病毒肺炎的治療，并且在臨床效果上取得了可喜的結果，間充質干細胞對免疫系統的雙向調節作用對新冠肺炎重癥患者出現的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)有積極作用。很多病人由重轉輕，甚至治愈。這讓我們對干細胞治療技術有了極大的信心。
目前干細胞制劑還沒有統一的質量標準，因為干細胞表面的標志物有時不穩定，這造成了干細胞鑒定和分類的困難。在數量上，用于臨床治療的干細胞也不能無限擴增，因為隨著擴增次數的增加，基因突變會逐漸積累，這增加了遺傳風險。有鑒于此，干細胞相關法規亟待進一步完善，各國的監管部門、美國FDA 以及我國國家衛生和計劃生育委員會、國家食品藥品監督管理局，都對干細胞研究技術制定了相應的指導原則，以支持細胞治療產業的發展。
細胞治療產品的特點
如今細胞治療的前沿發展方向都與基因編輯技術結合起來如CAR-T，iPSC等，使其不僅具有細胞產品的特點還兼有基因產品的特性。與研究成熟的小分子相比，細胞和基因治療的一些產品相對缺乏臨床經驗。很多文獻中的臨床數據多是小樣本、單中心，由于試驗人群的特殊性，對于可能與特定類型的細胞和基因治療產品相關的安全性可能存在相當大的不確定性。此外，一些細胞與基因治療產品在單次給藥后可在人體中持續較長時間，或即使在產品本身不再存在后仍有較長時間的效果，且產品的效果可能會隨著時間的推移而變化。
細胞治療產品的治療方式是多樣的，可能是靜脈輸注，也可能需要手術或其他侵入性操作才能到目標部位。那么手術增加的風險也可能是整個治療風險的一個重要組成部分。
另外，對于異基因細胞治療產物、基因治療載體和可能由細胞和基因治療產物產生的蛋白質具有誘發免疫原性的可能。一是已經存在的抗體，或在給藥后產生的抗體可能會減少或消除正向效果，引起不良反應（如自身免疫綜合征），或影響安全性或在有后續給藥時降低療效。二是對于那些可以用細胞、組織或器官移植來治療的患者，可能會產生排異反應而影響移植。
細胞治療產品的生物分析
對于細胞治療產品，可能在細胞膜上呈現多種分子，并表達多種因子，（比如，國際細胞治療學會定義干細胞，要求超過95%的細胞表達細胞表面標志CD105、CD73、CD90、CD44、CD29，絕大多數不表達造血細胞表面標志CD31、CD45、CD34、CD14、CD11b，CD79a及CD19等，也不表達MHCⅡ類分子）。這些分子和因子可能受到微環境的影響，并隨時間發生變化。細胞在體內可能分化成不需要的細胞類型。細胞也可能向其他方向發展治療功能，干細胞可能發展成多種成熟的組織類型，可以進行轉換，并開始形成腫瘤。細胞治療產品還可能是多種細胞類型的混合，比如免疫細胞群，并且可能不清楚哪種細胞類型是起效的主要類型。
另外，細胞治療產品的全身遞送可能導致細胞分布到身體的各種組織，即使是移植到特定組織或器官的細胞也可能會遷移到意想不到的位置，此時檢測細胞的轉歸與追蹤也具有挑戰。細胞治療產品的表型鑒定監測及分型計數分析都需要流式細胞術（FCM）,陽光德美采用4激光11色流式細胞儀，結合多維流式分析技術可以支持更全面的細胞表型及分型分析。
而基因治療產品，被傳遞基因的表達可能是不受控制的，并干擾受體中關鍵酶、激素或其他生物過程的正常功能。一些基因治療產品是設計成整合到受體細胞的DNA中長期表達，這種基因組的改變可能導致鄰近基因的激活或失活，從而產生良性或惡性腫瘤。
對于基因修飾的細胞，或體外基因治療產物，是將基因導入體外細胞，然后將修飾后的細胞注入受試者體內的產物。這類產品既有基因產品的特點，也有細胞產品的潛在風險。
鑒于細胞和基因治療產品的特殊性和復雜性，早期臨床試驗不僅要評估特定劑量水平的安全性，還要評估如給藥的可行性和藥物的活性等其他問題。我們在檢測中也需要對產品的生物學特性有一個適當的理解，以便開發效力檢測，并且需要收集足夠的產品特性數據，即在整個臨床前和臨床開發過程中(包括分子、生化、免疫學、表型、物理和生物學特性)來指導和完善方法，在臨床試驗設計上都要全面的考慮。
對于每一種細胞治療產品，在體外刺激、定向誘導和基因改造過程中都要對其標志物或基因進行檢測，在臨床檢測中也需要盡可能地評估細胞產品的作用機制以及藥效。如靶向CD19特異性CAR-T細胞的動態變化已經通過流式細胞術和定量PCR技術得到了廣泛的研究。流式細胞技術主要是檢測細胞表型和分型，而陽光德美采用的qPCR主要是針對CAR基因陽性T細胞以及CAR基因拷貝數。盡管由于CAR轉基因的沉默，會導致PCR的檢測偏差，但文獻報道這兩種方法的結果有很好的相關性。研究表明，CAR-T細胞的移植和輸注后的持續與臨床療效相關。CAR-T細胞由于細胞重新分配到組織中而在輸注后的24~48小時內迅速下降，之后2周內達到CAR-T細胞濃度的峰值，且到達峰時含有大于80%的循環T細胞，之后CAR-T濃度隨后下降；然而，這種下降的速度在個體之間是可變的，數周到數月的時間內不等。CAR-T細胞濃度隨時間變化的曲線在28天內的峰值濃度和面積與治療后的臨床反應高度相關。
與此同時針對CAR-T引起的細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經毒性，還需要檢測多種細胞因子或biomarker，以便更好地闡明其作用機制和藥效。陽光德美有多個分析平臺如MSD、Simoa等，在檢測細胞因子和biomarker上都具有更高的靈敏度與準確度，可以提供更多的選擇。美國血液與骨髓移植學會（ASBMT）也提出了一個關于CRS和神經毒性的評估分級系統來指導臨床研究。
結語
細胞治療已經成為現代醫療的熱點，免疫細胞對于多種癌癥的治療和干細胞對于疑難癥和罕見病的治療有望達到“治本”的目標。目前細胞治療臨床研究百花齊放，臨床試驗科學合理的開展也給我們帶來了新的機遇與挑戰，在細胞治療臨床研究相關的檢測與評價上我們可以提供更全面、規范的分析方案及更多的分析檢測。未來細胞治療將會成為一個標準化、規范化的常規醫療手段被廣泛接受與應用，對于細胞治療產品的臨床檢測也會有更高的要求，相信未來會有更多的細胞治療產品為患者帶來希望。
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